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免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体或抗原,作为探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术测定含量。
试剂与仪器:
磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4
荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释
缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)
有盖搪瓷盒一只(内铺一层浸湿的纱布垫)
荧光显微镜、玻片架、滤纸、37℃温箱等。
实验步骤:
1. 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。
2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(30min)。
3. 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。
4. 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。
5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:(-)无荧光;(±)极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(++)荧光明亮;(+++ --++++)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上,而各种对照显示为(±)或(-),即可判定为阳性。
实验操作:
1.细胞准备。对单层生长细胞,在传代培养时,将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片,PBS洗两次;对悬浮生长细胞,取对数生长细胞,用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次,用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
2.固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮钠的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3*5次。
3.通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞,一般需要在加入抗体孵育前,对细胞进行通透处理,以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3*5min。
4.封闭。使用封闭液对细胞进行封闭,时间一般为30min。
5.一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次,每次冲洗5min。
6.二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次,每次冲洗5min后,再用蒸馏水漂洗一次。
7.封片及检测。滴加封片剂一滴,封片,荧光显微镜检查。
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