常用分离纯化手段包括：膜分离技术、沉淀分离技术、电泳分离技术、层析分离技术。其中膜分离技术与沉淀分离技术属于蛋白粗提取，电泳分离技术主要应用于检测分析。蛋白纯化目前主要选择层析分离技术，通常分为以下几种方法：
纯化方法 | 原理 | 适用范围 |
凝胶过滤层析 | 根据分子间的大小或者形状差异进行分离 | 特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。 |
离子交换层析 | 根据蛋白质分子表面静电荷的差异进行分离 | 阳离子交换主要是改变pH，主要应用于等电点大于5的蛋白质；阴离子交换主要是改变盐浓度，适用于大部分蛋白质，除杂能力较强，对热源质、核酸、外毒素及电荷性有差别的蛋白效果显著。 |
疏水层析 | 根据蛋白质与疏水吸附剂之间的疏水作用差异进行分离 | 适用范围广，原则上可用于所有蛋白质的纯化，适合于从大体积中提取低含量的目标蛋白，对DNA及小牛血清去除率较高。 |
亲和层析 | 根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的 | 适用于抗原抗体亲和纯化，以及一系列标签纯化。 |
亲和纯化常用标签
常用类型有：HIS标签（镍柱纯化）、GST标签（谷胱甘肽）、Flag标签、MBP标签、Strep tag标签
比较项目 | 大小 | 纯化原理 | 特点 |
HIS Tag | 一般为6-8个组氨酸组合 | 组氨酸残基上的咪唑基团可与层析介质中的金属离子螯合，再通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱达到纯化效果 | 标签小，纯化简单； 能与其他标签形成双标签； 能纯化可溶性/包涵体蛋白 |
GST Tag | 26KD | 利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱原理来进行纯化 | 可溶性标签，提高蛋白表达的可溶性； 不能应用于包涵体等需变形处理的纯化 |
Flag Tag | 8个氨基酸 DYKDDDDK | 琼脂糖上偶联有flag抗体，可采用竞争性洗脱或酸性洗脱 | 在真核表达系统中表达效率更高； 可以纯化有活性的融合蛋白， |
MBP Tag | 42.5 KD | 多糖树脂吸附 | 可以减少目标蛋白的降解，增加蛋白的表达量和稳定性，提高表达产物的水溶性，但标签较大， 对蛋白的结构和功能会有一定影响。 适用于包涵体的纯化 |
Strep Tag | 8个氨基酸 WSHPQFEK | 生物素（biotin）和抗生物素蛋白链菌素（streptavidin）之间的结合反应。 | 纯化流程温和能保持目标蛋白活性； 能进行变性条件下的纯化； 价格相对HIS Tag而言较高 |
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