一、冰冻切片或石蜡切片：免疫组织荧光，一定首选冰冻切片而非石蜡切片。两者的区别主要在于冰冻切片能较完整地保存抗原免疫活性，但组织结构会受到冰晶等的影响而变形，石蜡切片则相反。虽然石蜡切片可以做抗原修复，但是，它不是麻烦嘛！所以想听冰冻切片做免疫荧光的故事，请继续拜读，啊呸，垂阅下文。

二、灌流和固定：4% PFA 动物心脏灌注。如今实验动物多为啮齿动物，以 SD 大鼠为例：麻醉，固定头和四肢，开胸腔，暴露心脏，灌流针插入左心尖（也就是左心室），右心耳剪个小口同时打开蠕动泵开关开始灌流，先 PBS 后 PFA，最后解剖目标组织于 4% PFA 中浸泡，4 度 24 h。麻醉和开胸腔不用说。灌流针插入心尖的时候，理论上应插到主动脉附近，但实际上此操作很容易插错从而进入肺循环导致灌流失败，所以此时可以使针尖刚刚穿过心尖到达左心室即可。接着，右心耳剪口，开启灌注，两者保持一致。

注意：灌流时管道不允许有气泡。PBS 灌流结束标志以肝脏变白和流出澄清液体为准，PFA 灌流成功标志位肝脏变硬为准，灌得好的大鼠四肢会抽搐几次，成年 SD 大鼠 250 ml PBS 和 250 ml PFA 足矣。

三、脱水：10%，20%，30% 蔗糖的 PBS 溶液梯度脱水。脱水这一步直接关系到后面切片的冰晶的形成，脱水脱不好则冰晶较多，片子空洞较多，结果相当丑。此时应使溶液的体积超过数倍于组织的体积，沉底即可换液，直到组织块在 30% 的蔗糖溶液中沉底。沉底后就不要放置太长时间了，应迅速进行下一步。

四、包埋：组织块修好后放入合适的包埋盒，加入 OCT 包埋剂，液氮或干冰速冻，放入 -80 冰箱保存。现在普遍用 OCT 包埋剂（optimal cutting temperature compound），是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，目前已广泛用于免疫组化实验室中，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。又因 OCT 混合物为水溶性，故在漂片时可溶于水，所以在以后的染色中不会增加背景染色。

五、切片和贴片：切片是一门学问，不练几个月你是没法入门的。而且这也不是光看文字就能学会的。但万变不离其宗，切出来的片子的好坏与你包埋的好坏、机器各部分之间的角度和距离等参数和你的操作习惯的好坏是密切相关的。

六、免疫荧光：漂洗，封闭，敷一抗，漂洗，敷二抗，漂洗，封片，镜检。所有的免疫荧光基本上就这一套流程。先说洗，怎么洗？溶液刚好浸没载玻片，摇床漂洗，洗三次。不用怕掉片，只要你买的多聚赖氨酸预处理的载玻片质量过关，在保质期内，一般不会掉。然后封闭，封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，也可以用小牛血清，羊血清等，大多数二抗来源为羊，所以多数情况用羊血清没问题，封闭液里也包含 0.2% triton-X100，通透作用，孵育室温 1.5 h。一抗一般 4 ℃ 过夜，效果较好，还可以回收抗体，二抗可以室温 1.5 h，此时的二抗都是荧光二抗，一定避光操作。接下来，封片剂封片，不要有气泡，然后镜检，保存可以放 -80 ℃。前文的漂洗液以及其他溶液的溶剂都为 PBS。几点需要注意，全程的溶液孵育过程要用湿盒，或者用其他办法保持片子的湿度以免溶液蒸发。所有步骤的时间都是可调的，各试剂的浓度也可根据具体实验来变动，根据实验条件环境温度等。

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