实验步骤：

（1）实验前将保存在 -20℃ 的基质胶转移至 4℃ 冰箱融化过夜，使用前用无血清培养基按培养基：基质胶 = 2:1 的比例稀释；

（2）接种前将 24 孔板和 Transwell 小室用 1×PBS 浸泡 5min 湿润小室。（侵袭实验需要加一步：在小室中铺 80µL matrigel 胶，37℃ 培养箱中放置 30min 使其凝固。）

（3）用胰蛋白酶消化细胞后，用无血清培养液洗涤细胞，用含有 1%FBS 的培养基重悬细胞，计数，稀释细胞悬液到 2×105 细胞/mL(侵袭实验中稀释细胞悬液到 4×105 细胞/mL)，接种到 Transwell 小室内，每个小室加 0.3mL 细胞悬液（侵袭实验中每个小室加 0.2mL 细胞悬液），下层的 24 孔板中加入 0.70mL 含 10%FBS 的完全培养液，每组 3 复孔，置于 37℃ 培养箱中培养 24h；

（4）培养 24h 后（侵袭实验培养 48h 后），每孔加入 1mL 4%溶液，室温固定 10min；

（5）染色：吸去固定液，用 1×PBS 洗涤一次，每孔加入 1mL 0.5% 结晶紫溶液，染色 30min 后用 1×PBS 洗三次，晾干；

（6）观察：用棉签小心擦去 Transwell 小室内没有迁移的细胞，置于 200×显微镜下观察，计数每个视野中的细胞数。

（7）统计分析

注意事项：

1.将小室放入培养板时，要注意不要有气泡产生，因为一旦有气泡，下层培养液的趋化作用就减弱了。

2.用棉签小心擦去 Transwell 小室内没有迁移的细胞时，不能碰到已经穿膜的细胞。

3.难穿膜的细胞可以用无血清培养基饥饿处理 12-24h。

具体沟通：400-9688-170

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