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实现免疫细胞高效基因转导的三个步骤

添加时间:2022-12-06

到目前为止,原代免疫细胞的转染是具有挑战性的。特别是大家感兴趣的细胞类型,如T淋巴细胞、自然杀伤细胞和B细胞,用经典的基于试剂的方法很难转染。使用转染试剂的主要问题是转染效率低、细胞毒性和免疫原性。后者在免疫治疗方面是不利的,因为细胞应该维持它们在免疫系统中的功能,而不是被转染方式预先激活。

步骤1-选择合适的转染方法


通过病毒转导,可以将感兴趣的基因整合到宿主基因组中。最常用的是慢病毒载体,慢病毒载体尚不能将目的基因插入到特定位点而是随机插入。

 

一种将底物递送到人体免疫细胞的便捷技术是NucleofectorTM技术,这是一种改进的电穿孔技术。专用的NucleofectorTM解决方案与针对特定细胞类型优化的电转参数相结合,使研究人员能够实现高转染效率和良好的存活率。底物直接输送到细胞质和细胞核。最小化的免疫原性保留了免疫细胞的功能



步骤2-让你的免疫细胞循规蹈矩

 

不管底物递送的方法是什么,免疫细胞在转染前的状态决定了之后细胞的活性和功能。细胞对转染过程的反应有多强烈或敏感,一方面取决于分离过程,另一方面也存在供体特性的问题。

 

能够获得血液或骨髓样本以自我分离免疫细胞的研究人员,应确保遵守既定的分离、刺激免疫细胞的标准操作程序。严格按照说明操作将产生可比较和可重现的结果。

 

如果无法获得这种来源,研究人员就会利用商业上可获得的造血细胞和免疫细胞进行研究。这有利于在质量控制和优化培养系统方面的工作。

 

然而,无论细胞的来源是什么,原代细胞都是来自单个有机体的细胞。捐赠者特定的差异是不可避免的,并将导致结果差异



步骤3-准备好稳定的底物递送
 

对于病毒转导来说,病毒颗粒的制备是复杂的,而用于改良电穿孔的底物选择则更加多样化。

 

为了确保最佳的条件,底物应该是高质量的。当我们选择质粒DNA进行基因递送时,有许多需要考虑的方面,关于载体DNA的信息可以在Lonza Important Vector Factors for Gene Expression Technical Reference Guide中找到。

 

底物的大小和浓度是这个游戏中的额外玩家。底物大小本身通常不是影响转染效率的主要因素,但当质粒大小超过约15kb时,效率会有所下降。因此,在转染较大的质粒时更要考虑实验所需的DNA量和质粒的完整性。增加每个反应的DNA含量通常会提高转染效率,但由于高浓度的DNA可能会对细胞产生毒性,细胞存活率可能会降低。对于Nucleofection实验,推荐的底物浓度通常在2-5ug/100ul(DNA)、2 nM-2uM(siRNA)和10-20ug/100ul(mRNA)之间。



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