酵母免疫荧光

 1 ）细胞制备

 1． 培养 5ml 酵母至对数生长早期（ 106 ～ 107 细胞 /ml ）。

2． 直接加 1/10 体积的甲醛到培养基里固定细胞（加入的甲醛终浓度为 3.7 ％，标准母液是 37 ％）。

3． 细胞在甲醛中培养至少 1 小时。

4． 离心收集细胞，用 0.1mol/L 磷酸钾（ pH7.5 ）洗一次。

5． 把细胞悬浮在 1ml 的 50mg/ml 消解酶 100T 或 50 单位 /ml 的溶细胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巯基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸钾溶液中 ] 。

6． 置 30 ℃培养 30 分钟，用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色，亮细胞（折射体）属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

7． 离心收集细胞，悬浮在 1ml 的 PBS 中。

 2 ）染色

 1． 取 10ml 的 1mg/ml 聚赖氨酸，放到用特氟隆封闭的（ Teflonmasked slides ）载玻片（ 10 孔载玻片）上的每个孔，再用蒸馏水洗载玻片，干燥。

2． 放 10ml 固化细胞到每个孔中，几分钟后，用 PBS 抽洗 3 次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

3． 该步骤可任选（本实验不需要使用抗体，但建议使用）：把载玻片浸泡在冷甲醇（－ 20 ℃） 6 分钟后，然后放到冷丙酮（－ 20 ℃） 30 秒，该处生理产生扁平细胞，有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体 - 抗原结合物，需要这些步骤重新活化，用 PBS 重新润湿玻孔。

4． 加 15ml 由 PBS ＋ 3 ％ BSA （牛血清白蛋白）组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中，如垫有湿纸巾的平板中保温 30 分钟。重要的是，在这期间不能让载玻片孔干透（ BSA 可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片）。

5． 吸出阻断缓冲液，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗两次。

6． 加 10 ～ 15ml 第一抗体（溶解在 PBS ＋ 3 ％ BSA ）到载玻片孔中，在一个保湿盒中保温 1 小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体，如果可能，用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

7． 吸出第一抗体，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。

8． 用荧光第二抗体重复第 6 ～ 7 步（在暗处培养）。

9． 吸出第二抗体，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。

10．  加 10 ～ 15ml 的 1 μ g/ml DAPI 到载玻片孔中，培养约 1 分钟，用 PBS 洗 3 次。

11．  吸出 PBS ，给每个孔加一小滴封固剂，放盖玻片，避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂，小心不要移动盖玻片，用干净的指甲油密封，－ 20 ℃下保存。

免疫荧光

 1 ）细胞制备

 1． 培养 5ml 酵母至对数生长早期（ 106 ～ 107 细胞 /ml ）。

2． 直接加 1/10 体积的甲醛到培养基里固定细胞（加入的甲醛终浓度为 3.7 ％，标准母液是 37 ％）。

3． 细胞在甲醛中培养至少 1 小时。

4． 离心收集细胞，用 0.1mol/L 磷酸钾（ pH7.5 ）洗一次。

5． 把细胞悬浮在 1ml 的 50mg/ml 消解酶 100T 或 50 单位 /ml 的溶细胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巯基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸钾溶液中 ] 。

6． 置 30 ℃培养 30 分钟，用相差显微镜检查原生质的生成率。细胞应呈黑色或半透明灰色，亮细胞（折射体）属于没有充分被消化的。菌蜕属消化过夜。

7． 离心收集细胞，悬浮在 1ml 的 PBS 中。

 2 ）染色

 1． 取 10ml 的 1mg/ml 聚赖氨酸，放到用特氟隆封闭的（ Teflonmasked slides ）载玻片（ 10 孔载玻片）上的每个孔，再用蒸馏水洗载玻片，干燥。

2． 放 10ml 固化细胞到每个孔中，几分钟后，用 PBS 抽洗 3 次。用显微镜检测载玻片确保呈合适的密度而不聚集。

3． 该步骤可任选（本实验不需要使用抗体，但建议使用）：把载玻片浸泡在冷甲醇（－ 20 ℃） 6 分钟后，然后放到冷丙酮（－ 20 ℃） 30 秒，该处生理产生扁平细胞，有助于细胞骨架的观察。对于一些抗体 - 抗原结合物，需要这些步骤重新活化，用 PBS 重新润湿玻孔。

4． 加 15ml 由 PBS ＋ 3 ％ BSA （牛血清白蛋白）组成的阻断缓冲液到玻孔中。在保湿盒子中，如垫有湿纸巾的平板中保温 30 分钟。重要的是，在这期间不能让载玻片孔干透（ BSA 可通过阻断蛋白质结合位点降低非特异抗体结合到载玻片）。

5． 吸出阻断缓冲液，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗两次。

6． 加 10 ～ 15ml 第一抗体（溶解在 PBS ＋ 3 ％ BSA ）到载玻片孔中，在一个保湿盒中保温 1 小时。用亲和纯化抗体或单克隆抗体，如果可能，用缺乏目的抗原的同源对照。作一个没有第一抗体的对照也是有帮助的。

7． 吸出第一抗体，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。

8． 用荧光第二抗体重复第 6 ～ 7 步（在暗处培养）。

9． 吸出第二抗体，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。

10．  加 10 ～ 15ml 的 1 μ g/ml DAPI 到载玻片孔中，培养约 1 分钟，用 PBS 洗 3 次。

11．  吸出 PBS ，给每个孔加一小滴封固剂，放盖玻片，避免在孔中出现气泡。用纸巾除去多余的封固剂，小心不要移动盖玻片，用干净的指甲油密封，－ 20 ℃下保存。

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