在RT-qPCR的实验过程中，大家或多或少都会遇到扩增曲线异常、熔解曲线异常、重复性差等问题。
整理了SYBR Green染料法的常见问题及解决方案，以供大家参考。
正常的扩增曲线一般呈S型，Ct值最好在20-30之间。异常的扩增曲线包括Ct值偏大、无平台期、平台期下降等问题。
1）模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
2）qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。3）扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。4）体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。
可能是基线范围设置不当，这种一般是由于模板量过高导致的。建议减小基线的终点值（一般建议设置为Ct值-4），调整后见下图。1）RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。可能是ROX浓度和机型不匹配，建议调整ROX浓度，调整后见下图。（注）可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看扩增曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。可能是扩增程序设置错误，未进行荧光信号搜集，建议重新实验，增加扩增程序中延伸阶段荧光信号的搜集。①Ct＞35，熔解曲线Tm值＜80℃（一般正常qPCR产物，大小在100-300bp之间，熔解曲线Tm大多在80℃以上），可能是引物二聚体导致，可进一步优化引物。②有Ct值且＜35，表示反应体系被污染，可逐步排除污染源。 
NTC正常，NRC有Ct值，可能是RNA含有gDNA污染。建议用DNase I消化或使用含有gDNA去除的反转录试剂盒（如Cat NO.11141ES）。
【注】NTC是指将H2O代替模板的阴性对照反应；NRC是指将未反转录的RNA作为模板的阴性对照反应。1）加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
2）模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。熔解曲线常用来判断qPCR结果的特异性，理想的熔解曲线为单峰，异常的熔解曲线可能会出现双峰、杂乱等情况，下面我们来逐一分析。①可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。②可能是模板量过低，促使了引物二聚体的形成，建议提高模板量。①引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。②gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。1）反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。
2）试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。4）耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致同一产物解链温度Tm值不一样。可能是ROX浓度与机型不匹配，建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常，调整后如下图。【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。
