实验步骤

1) 

a.琼脂糖凝胶电泳检测基因组 DNA 完整性：电泳条带清晰可见，无明显降解，且无 RNA污染。

b.Nanodrop 2000 检测基因组 DNA 质量：浓度≥20 ng/μL，总量≥1 μg（可供 10 个多重PCR Panel 的检测），OD260/280 =1.7~2.0，OD260/230 ≥1.8；

2)  PCR  基于公司的专利软件，针对客户提供的目标区域设计高质量的测序引物。挑选能够以经重 亚硫酸盐处理的人基因组为模板，扩增获得清晰单一条带的引物用于后续实验。

3)  PCR  panel   将经步骤 2）优化后的引物混合为多重 PCR 引物 panel。并使用公司多重 PCR 的专利技术， 以标准人基因组为模板进行扩增。基于毛细管电泳的特殊方法，我们能够判断多重体系中每对引  物是否高效、特异地进行扩增，并以此调整，优化多重 PCR panel 中的引物组成及浓度。

4)使用 EZ DNA Methylation-Gold Kit 进行样本处理，将基因组 DNA 未被甲基化修饰的胞嘧啶C 转化为尿嘧啶U。

5) PCR  使用优化后的多重 PCR 引物 panel，以转化后的样品基因组为模板，进行多重 PCR 扩增。经质控后，将以同一个样品基因组 DNA 为模板的所有多重 PCR 引物 panel 的扩增产物混合，并确保每个位点引物扩增产物的量相当。

6) 利用带有 Index 序列的引物，通过 PCR 扩增向文库末端引入和 illumina 平台兼容的特异性标签序列。反应采用 11 个循环数的 PCR 程序，尽可能降低 PCR 的倾向性。

7) 将所有样品Index PCR 扩增产物等量混合，并经割胶回收获得最终的 MethylTarget 测序文库， 文库的片段长度分布经 Agilent 2100 Bioanalyzer 验证。文库摩尔浓度精确定量后，最终于 Illumina Hiseq 平台，以 2×150 bp 的双端测序模式进行高通量测序，获得 FastQ 数据。

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