【南京中科世康生物科技有限公司】提供专业的服务:动物实验外包,医学整体实验外包服务,Western Blot实验外包等......
逆转录PCR
PCR反应需要以双链DNA作为模板,因此最初的PCR反应用于检测目标样本的基因组中是否存在特定的目的片段,但是这种以基因组DNA为模板的PCR反应无法检测目的基因是否在样本中表达,此外由于真核生物的基因中存在内含子,直接通过基因组DNA进行PCR也很难确定样本中是否存在目的基因,针对这一问题,发展出了逆转录PCR的技术。
技术原理
逆转录PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR) 是以mRNA为模板,在逆转录酶作用下合成cDNA,之后再进行PCR的过程。
mRNA逆转录合成cDNA的过程分为两步:
RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品的分析成为可能,该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
1. RNA模板
通常20μL的逆转录体系,加入总RNA 1μg,如果总RNA加入过多,会导致逆转录不充分。
2. 引物
常用的有随机引物和Oligo(dT)引物:
引物 | 适用范围 |
---|---|
随机引物 | 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应 |
Oligo-dT | 适用于具有PolyA尾巴的RNA(原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴) |
基因特异性引物 | 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况 |
随机引物会将所有RNA分子均进行逆转录,此时得到的cDNA大部分来源于rRNA,主要在部分mRNA含有逆转录酶终止序列而难以得到其全序列时使用;
Oligo(dT)与真核生物mRNA的Poly(A)区域匹配,可以特异性的对mRNA进行逆转录。
3. 逆转录酶
逆转录过程涉及以RNA为模板合成DNA和以DNA为模板合成互补链的两个过程,目前市场上的逆转录酶都同时具有这些功能,因此只需在反应体系中加入逆转录酶即可,而不需额外加入DNA聚合酶。
4. 4种dNTPs
南京中科世康生物技术有限公司实验人员拥有十年的实战经验,跟多个高校、医院老师合作。除了分子实验,还有动物实验,细胞实验,病理实验等等,期待您的咨询~ 4009688170